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总结HPLC校正因子法在中药杂质定量方面应用的问题

更新时间:2023-03-08  |  点击率:5176

标准物质一直是药品质量控制特别是纯度和含量分析的重要选择,但标准物质的供需矛盾,如有些杂质标准物质不易获取以及多个标准物质同时使用所带来的高昂检测成本等限制了标准物质的实际应用。为解决这一问题,替代方法应运而生,高效液相色谱(HPLC)校正因子法便是其中之一。


该方法起初主要用于HPLC有关物质检查时对于特定杂质的定量,进而又逐渐用于中药多指标含量的测定,发展至今相对校正因子用于杂质的定量或者中药多组分活性成分的定量方法已经得到广泛的应用,但是其在使用过程中还存在一些问题需要统一或者规范,其在中药方面的应用已经有多人对相应的技术要求进行过建议和总结,但在杂质定量研究方面相关报道甚少,因此本文将文献中相对校正因子在杂质定量方面应用存在的一些问题进行了总结。


曲线是否需要强制过原点


对于色谱方法,校正曲线的斜率b=0是一种理想的状态,事实上由于每一台仪器都有其检测限度,需要待分析物达到一定浓度水平以后才能检测出信号,以及溶剂干扰等系统误差的存在,因此截距一般不会为0。


正的Y轴截距表示高浓度响应的饱和度或响应处有干扰存在,负的截距说明可能方法灵敏度有问题,或被分析物质残留在容器或者HPLC系统中。但是标准曲线法使用斜率求取校正因子的前提是假设截距b=0,由此可见无论是否对截距进行校正,这种方法对于相对校正因子的测定都会产生一定的误差。


目前对于标准曲线法求校正因子的截距和斜率未检索到明确的要求。因此文献对于校正曲线的处理也有两种方法,一种是将截距校正为0;大部分则未做校正。但校正因子在中药方面的应用中有一些相关要求的报道,如校正曲线相关系数r不得低于0.999,k/b值大于100时,b值可以忽略不计。


实例证明在中药多组分含量测定中采用截距校正后的曲线斜率求相对校正因子方法最为合理。但截距校正与否对校正因子计算会产生多大的影响,哪一种方式计算得到的杂质含量更为准确未见文献报道。


校正曲线浓度范围的选择


在进行杂质定量方法验证时,线性验证是方法验证中不可少的一项内容,由于在验证过程中要分别建立杂质和主成分浓度和响应值之间的校正曲线,可以就此以两校正曲线的斜率计算出相对校正因子,因此很多研究对于校正曲线浓度的范围便遵从线性验证的要求从定量限到限度值的120%~150%。也有专家建议标准曲线法测定校正因子的浓度范围要涵盖定量限和标准限度。


从目前检索到的文献看,有些文献的确涵盖了定量限和标准限度,有些则仅涵盖限度或未明确定量限,其中一些文献上限定了限度水平的200%甚至500%,高浓度范围对于溶液的配制可能更为简单,低浓度范围则更加接近正常杂质检测水平,不同浓度范围所得到校正因子是否有所差别未检索到文献报道。


校正曲线上浓度点的选择


在计算相对校正因子时,多采用线性验证时的校正曲线,因此一般要求至少制备5份不同浓度的对照品溶液用于校正曲线的绘制。在配置不同浓度的对照品溶液时应尽量采用逐级稀释,在校正曲线上的点也应均匀分布,也有一些文献浓度点分布并不均匀,如在低浓度处选点更加密集,曲线上浓度分布对校正因子的测定是否产生影响未见文献报道。


涉及校正因子的方法开发与验证


目前对于杂质与主成分相对校正因子的测定多在进行有关物质方法线性验证时直接以校正曲线的斜率顺带求得,仅在《中国药典》2015年版四部《9101药品质量标准分析方法验证指导原则》中明确规定了校正因子需进行准确度验证,但对于测定校正因子的方法开发以及耐用性验证没有明确的要求。


在检索到的有关化学药品具体品种校正因子的26篇相关文献中,有16篇文献在计算相对校正因子时考虑到了仪器、色谱柱的相关影响,以在不同仪器不同色谱柱上测定得到的均值作为校正因子;有11篇文献进行了校正因子的耐用性验证,但验证项目不一,主要涉及人员、实验室、仪器、色谱柱、流动相pH值和比例、流速、试剂等级、柱温、粒径等多个影响因素,其中检测波长、色谱柱、柱温、流速都被报道过对校正因子测定结果有显著影响。


由此可见,应该在方法开发时对于特定杂质相对校正因子的耐用性根据具体情况进行全面考察,如果校正因子发生明显变化,应对具体测试条件在方法标准中加以严格设定,这样相对校正因子才能作为一个常数,直接载入质量标准用于杂质的准确定量。


随着大众对于药品安全性认识和需求的不断提高,药品有关物质检查中进行特定杂质控制会逐渐成为药品质控的常态,标准物质无法及时供应的情况下,采用相对校正因子计算特定杂质的方法也会越来越普遍。相对校正因子将成为药品HPLC方法中用于杂质含量测定和限度检查过程中一个重要的参数。